科研 | 中科院：对高脂饮食诱导肥胖（DIO）和DIO+CCl4诱导的NASH小鼠以及奥贝胆酸效应的代谢组学分析（国人佳作）

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编译：微科盟向阳而生，编辑：微科盟Tracy、江舜尧。

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导读

非酒精性脂肪肝（NAFLD）的病理生理学是一个包括肝脏和其他器官在内的代谢性和炎症性变化的复杂过程，但是其发病机理仍然未完全阐明。本研究通过构建两个小鼠模型分别研究了非酒精性脂肪肝以及非酒精性脂肪肝炎的代谢变化，血清、肝脏和小肠内容物中的代谢物浓度通过AbsoluteIDQ^® p180试剂盒进行测定（Biocrates生命科学公司，Innsbruck，奥地利）。研究采用多变量统计模型、通路分析、富集分析以及相关性分析对代谢组数据进行分析，并鉴别出每组肝脏、血清和小肠内容物的代谢特征，表明发生了代谢扰动，其中，肝脏和肠道内容物的代谢变化更为显著。基于肝脏的代谢数据，我们在DIO组和对照组之间鉴别出19个差异的代谢物，在DIO-CCl₄组和DIO组之间鉴别出12个差异的代谢物，在DIO-CCl₄组和正常组之间鉴别出47个差异的代谢物。这些代谢物主要与氨酰基-tRNA生物学合成、氮元素代谢、脂类代谢、乙醛酸和二羟酸盐代谢和氨基代谢相关。进一步的研究表明奥贝胆酸（OCA）的干预可部分逆转CCl₄的损伤。对于代谢产物水平和临床参数的相关性分析表明卵磷脂与血清丙氨酸转氨酶、天门冬氨酸氨基转移酶、NAFLD活性评分、以及纤维化评分之间呈现负相关；而溶血磷脂酰胆碱类、鞘磷脂、氨基酸、以及酰基肉碱类共享这种负相关的模式。我们的研究考察了对照组，NAFLD模型，以及OCA处理组之间的代谢变化，为理解NAFLD和OCA的改善机制提供临床数据。

论文ID

原名：Metabolomic Study of High-Fat Diet-Induced Obese (DIO) and DIO Plus CCl4-Induced NASH Mice and the Effect of Obeticholic Acid译名：对高脂饮食诱导肥胖（DIO）和DIO+CCl₄诱导的NASH小鼠以及奥贝胆酸效应的代谢组学分析
期刊：Metabolites
IF：4.932发表时间：2021.06通讯作者：刘佳，冷颖
通讯作者单位：中国科学院上海药物研究所

实验设计

实验结果

1. NAFLD模型和OCA处理组的组织学特征
建立了NAFL高脂肪饮食（HFD）饲喂的肥胖小鼠模型，这些小鼠表现出脂肪肝但无脂肪性肝炎症状。与文献报道一致，添加了多种CCl₄制剂的HFD诱导肥胖对于构建NASH小鼠模型模拟人类NASH的几种特征是足够的。正如图1A所示，H&E染色的组织学检测显示HFD在DIO组的肝脏中诱导了脂肪肝的发生。与之前的报道结果一致，与CCl₄共处理导致了进一步的肝脏细胞膨胀、炎症、以及在DIO-CCl₄组出现中度的肝脏窦周或门静脉周的纤维化（图1A-G），同时我们在CCl₄处理组小鼠中观察到血清中TG，AST，以及ALT浓度的增加（图1l-k）。肝脏TG水平和Co1-1a1表达在DIO组和DIO-CCl₄组相对对照组表现出显著的增加（图1H, R）。接着，我们进行了OCA组的组织学特征分析，表明OCA处理可分别显著降低脂肪肝评分和肝炎评分达89.9%和72.7%（图1C，E）。其中，脂肪肝评分与对照组相比无显著差异。相比对照组（DIO-CCl₄），采用OCA治疗可降低血清中ALT的水平达50.9%，降低血清中AST的水平达62.9%。其中，OCA可降低血清中甘油三酯的浓度达到45.4%，但对胆固醇无明显效果。NAS评分在OCA处理后也表现出显著下降，降低至62.8%（图1F），但是肝脏膨胀评分几乎未变。采用OCA治疗可分别降低血清中甘油三酯、ALT和AST的浓度，这三种物质的浓度分别降低至45.4%，50.9%和62.9%（图1I-K）。服用OCA后肝脏/体重比例（%）比DIO-CCl₄组高8%，但未达到统计学显著水平（图1M）。由于已知FXR拮抗物可激活增殖通路，我们对OCA处理导致的周期蛋白D1、CDK1、CDK2和CDK4表达变化也进行了研究。CCl₄处理导致了周期蛋白D1和CDK4基因表达的上升（图1N，O），而CDK2和CDK4的表达未受到影响（图1P，Q）。OCA处理导致了周期蛋白D1的进一步上升，但是，与DIO-CCl₄组相比（图1N-Q），CDK1，CDK2和CDK4的表达未受到影响。天狼星红染色后的阳性区域在OCA处理后下降了41.5%（图1G），表明纤维化的改善。一种成纤维细胞样表型Col-1a1的表达，在DIO-CCl₄组中上升，而在OCA处理后显著的受到抑制（图1R）。与较低的炎症评分一致，趋化因子单细胞驱化吸引蛋白1（MCP-1）在肝脏中的表达通过OCA的处理而显著下降（图1S）。 图1 OCA对于脂肪肝的减轻作用，在DIO-CCl₄小鼠中的炎性响应和纤维化
（A）代表性的HE染色结果（放大比例×200）。（B）代表性的天狼星红染色结果（放大比例×50）。（C-F）脂肪肝评分，肝脏膨胀指数，炎症指数以及NAFLD活性评分（NAS）的组织学评估。（G）天狼星红阳性区域定量。（H）检测肝脏TG。（I-K）对血清中TG含量，ALT和AST含量进行度量。（L）体重以及（M）肝脏/体重比例。（N-S）肝脏中周期蛋白D1，CDK1，CDK2，CDK4，Col-1a1和MCP-1基因表达。DIO-CCl₄组：* p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005以及**** p < 0.001；对照组：^# p < 0.05，^##p <0.01，^###p < 0.005以及^#### p < 0.001。 2. NAFLD模型和对照组的代谢特征
为了获得肝脏，血清和小肠内容物样本的代谢特征，应用靶标代谢组学方法采用Absolute IDQ®p 180试剂盒进行分析（Biocrates生命科学公司，Innsbruck，奥地利），该试剂盒可精确度量188种代谢物的浓度。我们采用多变量（MVA）统计学分析观察在NASH模型中是否会出现代谢物的扰动现象。作为一种无监督模型，PCA的建立是基于相应数据（图2A），结果表明：PCA法对这些样本进行了很好的分组，并通过对肝脏，血清和小肠内容物样本的不同分组进行代谢物分离。同时相比血清和小肠内容物样本，肝脏对代谢物的聚集和分离效果最佳。在PCA分析的点图结果中，我们发现在DIO-CCl₄组和对照组之间代谢产物点的距离最远，而DIO组代谢产物点的距离更加接近对照组。这些结果表明DIO-CCl₄组的异常结果更加显著。之后，我们采用有监督的PLS-DA评分法检测对照组和NASH模型组之间显著的偏移，R²Y和Q²值显示出良好的解释能力和预测能力（R²Y对于肝脏、血清和肠道内容物的截距分别为0.925，0.954和0.979，而Q²截距为0.892，0.850和0.861）。我们通过200次重排分析检测该模型是否过度拟合（图2C）。R²和Q²的截距表明无过度拟合（对于肝脏、血清和小肠的R²的截距分别为0.219，0.754和0.867，而Q²截距分别为-0.326，-0.338和-0.174）。接着，我们采用热图对肝脏，血清和小肠内容物的代谢特征进行直观的表示（图3A-C）。该热图结果与PCA和PLS-DA分析结果一致。 图2 肝脏，血清和小肠内容物的代谢组学分析
（A）肝脏，血清和小肠的PCA评分点图。（B）肝脏，血清和小肠内容物的PLS-DA评分图。（C）采用200次重排分析对肝脏，血清和小肠内容物的模型验证。
3. NAFLD模型和对照组之间的代谢组学变化
正如上面所阐释的，NAFLD模型组的代谢特征与对照组存在显著差异。为了进一步发掘这些发生变化的代谢产物，我们采用了倍数变化分析以及t检验，并采用火山图进行可视化（图4）。基于Benjamini-Hochberg方法进行FDR校正，具有倍数变化（FC）>1.6或FC < 0.6，p < 0.05以及FDR < 0.05的阈值被定义为发生显著变化的代谢产物（补充表S2和S3）。我们在肝脏中总共发现47种代谢物的变化，其中血清中发生变化的有7种，肠道内容物样本中发生变化的有56种。为了进一步分析肝脏，血清和小肠内容物样本的差异，我们对上述代谢物进行了维恩图分析（图3D），结果表明肝脏和小肠内容物代谢物之间共享了17种共同的代谢物，而在肝脏和血清中仅共享5种，血清和小肠内容物之间共享1种，所以肝脏的代谢变化相比血清而言与小肠更为相似。综上所述，我们推测肝脏作为NAFLD的病理学组织，表现出更为显著的代谢组学变化。因此，后续的分析集中于肝脏的代谢变异。根据肝脏代谢组数据，19种代谢物在DIO和对照组之间具有显著差异（表1-3），其中，除了腐胺外大多数为脂类。我们在DIO-CCl₄组和对照组之间观察到47种差异的代谢物（表1-3）。12种代谢物在DIO-CCl₄和DIO之间具有显著差异（表1-3），还有两种代谢物，分别为PC ae C38:2以及SM C18:1，它们在所有三种不同的比较中被检测出来。 图3 肝脏，血清和肠道内容物的代谢组学分析
肝脏（A），血清（B）以及肠道内容物（C）的代谢特征。（D）差异代谢物的维恩图（数字为共享的差异代谢物）。 表1不同组间肝脏差异代谢物汇总（氨基酸）“-”：无显著变化；“↓”：显著下降；“↑”：显著上升.
 表2 不同组（PCs和LPCs）差异的肝脏代谢物总结“-”：无显著变化；“↓”：显著下降；“↑”：显著上升
 图4 肝脏（A），血清（B）和肠道内容物（C）代谢特征的火山图。
  表3 不同组（SMs和酰基肉碱）差异的肝脏代谢物总结“-”：无显著变化；“↓”：显著下降；“↑”：显著上升
 4. 采用代谢通路和代谢富集分析进行区别的NASH模型
为了分析代谢产物的代谢过程，我们采用MetaboAnalyst4.0进行通路分析和富集分析。通路分析显示总共有23条匹配的通路，正如图5A描述的，脂类代谢，包括甘油磷脂（GPLs）代谢、亚油酸代谢、以及ɑ-亚油酸代谢，在DIO组中受到扰动（p < 0.05）。氨基酰胺-tRNA的生物学合成、氮元素代谢、脂类代谢（与DIO组相同）、乙醛酸和乙二酸代谢、以及氨基代谢（包括精氨酸生物合成、精氨酸和脯氨酸代谢），D-谷氨酰胺以及D-谷氨酸盐代谢、丙氨酸、天门冬氨酸以及谷氨酰胺代谢、苯基丙氨酸、以及酪氨酸和色氨酸的生物学合成）在DIO-CCl₄和对照组之间也被观察到（p < 0.05）。5条通径在DIO-CCl₄和DIO之间发生变化，这些通径大多属于氨基酸代谢通径。 不仅如此，代谢物富集分析采用定量法（图5B），并发现在DIO-CCl₄组和对照组之间有5种代谢物表现出显著差异（p < 0.05），它们分别对应于酪氨酸代谢、辅酶Q和其它萜类化合物生物学合成、苯基丙氨酸代谢、苯基丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物学合成以及色氨酸代谢。另外，DIO-CCl₄组和对照组之间的差异与DIO-CCl₄组和DIO组相比较不显著，表明DIO-CCl₄的扰动主要与额外添加CCl₄有关。图5 肝脏代谢物的扰动通路和富集分析
（A）   差异代谢物的通路分析。（B）差异代谢物的富集分析。     5. 差异表达的代谢物和NAFLD相关参数之间的关联性分析
我们采用关联分析获得代谢组和NAFLD-相关参数之间关系的可视化图（图6，表S4）。临床参数，包括体重（BW）、肝脏/BW比值、TNF-ɑ以及ɑ-SMA与差异代谢物之间无相关关系；而ALP、ALB、BUN、血清TG、肝脏TG、Col-1a1以及肝脏功能标志（比如纤维化、脂肪肝、肝脏膨胀、炎症以及NAS评分）与差异代谢物存在显著的关联，其中，Col-1a1、ALT、AST、肝脏功能标志物、血清TG以及肝脏TG共享相同的模式，而ALP和BUN共享相同模式。除了精氨酸外，大多数代谢物与临床参数相关，Col-1a1、ALT、AST、肝脏功能标志物的水平与天门冬氨酸、脯氨酸、色氨酸、酪氨酸、t4 OH脯氨酸、腐胺、lysoPC a C18:1、几种肉毒碱和鞘磷脂（SM）水平相关，而几种磷脂酰胆碱类（PC）表现出相反的模式。图6 疾病参数和肝脏受到扰动的代谢物水平的相关性

6. 奥贝胆酸（OCA）对于NASH的改善作用
另外，我们研究了奥贝胆酸（OCA）的效应，OCA是治疗NASH的候选药物。我们期望代谢组学分析能够提供一些支持OCA治疗作用的解释。我们采用包括PLS-DA法以及热图分析在内的MSA分析可以更加清楚的了解服用OCA的效果。PLS-DA的结果表明：OCA组可从DIO-CCl₄组中鉴别出来并与DIO一同分组（图7A）。热图分析结果表明了相似的结果（图7C）。这些结果显示OCA可能减弱了CCl₄所导致的损伤。OCA对于代谢物的效应通过比较DIO-CCl₄组和OCA组的差异的代谢产物水平而获得（图8）。OCA的干预增加了PC的水平（诸如PC aa C36:6，PC ae C38:0以及PC ae C38:0），而OCA降低了酪氨酸、腐胺、脯氨酸、色氨酸、精氨酸、丁酰胆碱酯酶、SM C16:0、SM C16:1、SMC18:0、SMC18:1、SM（OH）C14:1以及SM（OH）C16:1的水平。其中，脯氨酸、色氨酸、丁酰胆碱酯酶、SM C16:0、SMC18:1、SM（OH）C14:1以及SM（OH）C16:1在OCA组中与对照组中相似，表明这些代谢产物可能与OCA的调控作用有关。图7 在对照组，模型组和OCA处理组之间的代谢组学分析
（A）肝脏的PLS-DA评分图。（B）采用200次重排检测的PLS-DA模型验证。（C）肝脏代谢组特征的热图。  图8 肝脏差异代谢物的提琴图
DIO-CCl₄组：* p < 0.05，**p < 0.01，***p < 0.005以及**** p < 0.001；对照组：^# p < 0.05，^##p <0.01，^###p < 0.005以及^#### p < 0.001。

讨论

目前，NAFLD的流行显著增加（从2005年的15%到2010年的25%），而患NASH的比率几乎翻倍（59.1%比33%）。相比NAFL，NASH可更容易转化为肝硬化或者HCC。但是，从NAFL到NASH的过渡的机制仍然未被完全了解。OCA被显示在随机化的，安慰剂控制的临床研究中可提高病人的肝脏组织学特征。在当前的研究中，我们旨在提供可以帮助理解NAFLD进程和改善NASH症状的OCA的作用机制。结果表明DIO的处理可导致脂肪肝和肝脏膨胀。作为肝脏细胞损伤的标志物，ALT和AST的水平在DIO-CCl₄组中显著提高，提示肝脏细胞损伤主要由CCl₄所导致。对照组和NAFLD组的PCA和PLS-DA分析结果表明不同组之间明显的差异，表明在不同情况下代谢物水平的变化。另外，肝脏样本表现出各种代谢物最佳的分离，表明代谢变化可能最多的发生在肝脏中。给DIO-CCl₄组小鼠进行OCA注射显示出血清中ALT，AST和TG的显著下降，以及脂肪肝、炎症和纤维化的发生，这些现象在之前的研究中也被观察到。根据对DIO和OCA组的近距离观察，四个组的PLS-DA点状图表明OCA处理可能减轻了CCl₄的损伤。我们采用火山图研究了不同代谢产物的特征，代谢谱显示出几种代谢通路以及与NAFLD疾病发展相关的特定的代谢物（从对照组到NAFL到NASH）。相比肝脏、血清、肠道内容物、肝脏和小肠内容物显示出比血清更多的差异的代谢物。血清中代谢物的变化可能反映了整个机体对于疾病的响应，同时在血液循环过程中，肝脏的病理学表现可能会减弱。不仅如此，肝脏和肠道内容物共享了更多的受到扰动的代谢物，特别是11 酰基-烷基-GPLs（其中PC ae C组）以及两个SPs（SM（OH）C和SM C组）。根据之前的文献报道，内脏和肝脏基于其不同的代谢功能而具有内在联系。内脏-肝脏轴的变化，包括肝脏通透性的增强和功能失调，与NAFLD相关。与DIO，DIO-CCl₄和对照组的代谢物相比，仅有19种和12种差异的代谢物在DIO组和对照组，DIO组和DIO-CCl₄组之间被发现，而47种代谢产物在DIO-CCl₄组和对照组之间被发现。这些结果表明在对DIO组和CCl₄组进行共处理后可增加代谢产物间的距离。通路和富集分析结果表明脂类代谢和氨基酸代谢与NAFLD的发生相关，并受到其调控。其中，相比DIO组和对照组，SPs代谢和GPLs代谢显示出显著的扰动，与上述两组相比，氨基酸代谢在很大程度上发生了变化。结果表明：HFD可能改变了脂类代谢，而CCl₄可能扰动了氨基酸代谢。在最近的对于NAFLD、NASH和肝硬化的脂类组学研究中，共有48个脂类在肝脏和血浆中被检测出来。其中，SPs和GPLs在某个特定的疾病阶段最易被检测到，并且我们也发现SPs和GPLs的水平在NAFLD过程中被扰动。对于脂类代谢的详细分析显示PC aa C组的浓度（双酰基-GPLs）下降。PC和C组的水平也表现出下降，除了PC ae c34:0和PC ae C38:5，而溶血磷脂胆碱（LPCs）以及鞘磷脂（SMs）在除SM C24:0上调组的其他组中被检测到。不同代谢物和临床参数之间的相关性分析表明除了PC ae C34:0 以及PC ae C38:5以外的PCs水平，还与肝细胞损伤指数（ALT和AST）和NASH的临床标志（纤维化评分、脂肪肝化评分、膨胀评分、炎症评分、以及NAS评分）相关。PC以及磷脂酰乙醇胺（PE）是哺乳动物细胞膜的主要磷脂。之前的文献报道肝脏的PC/PE比值显示出重要的临床意义。很多患NAFLD和NASH的患者相比健康人具有较低的比值。在我们的研究中，PE的水平几乎未改变，而PC表现为显著下降。所以肝脏PC/PE比值下降，这与文献报道一致。降低的比值可影响细胞膜的通透性，导致肝脏损伤。另外，降低的PC/PE比值可引发炎症，这是由于离子流（比如钙离子）和离子自由基在细胞膜上的通透性潜力，以及在炎性响应蛋白的C反应蛋白中可发生变化，从而更加紧密的与细胞膜膜结合。但是，LPCs和SMs的水平，除了SM C24:0，表现出与PCs相反的关联模式。由于SM可降低胰岛素和脂肪肝的敏感性，一些之前的工作表明SMs水平在HFD饲喂小鼠的肝脏和血清中增加，对人类血清的代谢分析表明SMs可能在NASH的患者中上调。不仅如此，氨基酸代谢在不同组之间也发生了显著变化，因为肝脏是蛋白质和氨基酸代谢的场所。8种氨基酸（精氨酸、天门冬氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、t4 OH 脯氨酸、色氨酸、腐胺）表现为上调，同时，谷氨酸和DOPA下调。通径分析表明：苯基丙氨酸、酪氨酸以及色氨酸的生物学合成、D-谷氨酰胺和D-谷氨酸盐代谢、以及精氨酸和脯氨酸代谢受到显著的扰动。最近基于代谢的研究表明氨基酸代谢在NAFLD病理学过程中发挥了重要作用，同时芳香性氨基酸（AAAs，比如酪氨酸和苯基丙氨酸）在严重的肝脏疾病中也被发现发生了变化。非必需氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、谷氨酸盐、以及谷氨酰胺、天门冬氨酸盐、天门冬氨酸以及丙氨酸）和必需氨基酸（缬氨酸和甲硫氨酸）被报道出现在NASH相关的症状中。另外，酰肉碱（比如丁酰肉碱、硫甲酰肉碱、戊二酰肉碱、以及辛烷酰肉碱）也受到影响，这些物质与肝脏细胞损伤指数和NASH的临床标志呈现正相关。肉毒碱的变化被报道可导致高线粒体脂肪毒性、脂类负担以及脂类代谢的变化。另外，我们分析了对照组，DIO组，DIO-CCl₄组和OCA组的差异代谢物，目的是研究OCA的处理是否调控了代谢产物的变化。正如图8所示，OCA能够降低几种SMs，氨基酸（脯氨酸、酪氨酸、精氨酸、色氨酸以及腐胺）以及丁酰肉碱的水平，同时增加几种PCs的水平，但LPCs未观察到显著的变化。氨基酸能够通过抑制FAS基因的表达和蛋白质水平减轻与NASH脂肪肝和肝脏损伤的程度，PC直接作用于肝脏TG合成并促进脂肪肝的发生。与组织学以及代谢特征相结合，脂肪肝评分和肝脏TG在氨基酸和PCs水平改变的过程中显著下降，这表明OCA可能通过氨基酸代谢逆转脂肪肝症状，同时逆转PC的生物学合成和脂蛋白的代谢。LPC通过磷脂酶A₂产生，并且与NASH的细胞损伤和凋亡相关，同时可以导致细胞膜毒性并促进炎症发生。OCA能够降低LPCs的水平，表明OCA不能降低膜的毒性和对细胞的损伤。在当前的研究中，我们通过高脂饮食饲喂小鼠（60%脂肪）6周，诱导小鼠从NAFL过度到NASH，然后向腹腔内注射CCl₄同时保持高脂肪饮食4周。这是一个在短期内针对抗脂肪肝和抗肝脏纤维化治疗验证研究的有效小鼠模型。但是，此模型并不能逼真的模拟NASH的自然发生病因，该病程在人体中可能需要数十年。传统的西式饮食——高脂肪、高果糖、高胆固醇可在饲喂26周后引发小鼠肝脏胰岛素的抗性，产生脂肪肝、炎症以及窦周纤维化。进一步的研究可能在西式饮食中开展——在未来研究不同代谢物之间的关联性，以及NASH的组织学和代谢特征。

原文链接：  

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34200685/

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